生物絮凝劑一般來自微生物胞外分泌物，它 的優勢體現在生物來源，具有綠色、易降解、無二 次污染特點。目前已經廣為使用的利用活性污 泥中的微生物處理生活污水，就是微生物代替化 學物質用于環境處理的成功范例，在活性污泥中 存在著生物絮凝菌，它們利用自身分泌的胞外物 質結合污水中的懸浮顆粒，形成大的絮凝團，加速 污泥沉降，同其他細菌、真菌和原生動物一起，去 除污水中的有機物，降低污水的 ＣＯＤ 和 ＢＯＤ 指 標以達到出水標準。

１ 材料與方法

１．１ 材料

活性污泥：采樣自低溫生物反應器填料池；低 溫生物膜：采樣自低溫生物反應器污泥回流裝置； 低溫生物反應器運行在哈爾濱工業大學環境工程學院實驗室。 供試儀器主要有紫外分光儀（普析通用儀器 有限責 任 公 司）、超 凈 臺 （蘇 州 凈 化 設 備 有 限 公 司）、恒溫培養箱（上海南榮實驗設備有限公司）、 滅菌鍋（日 本 三 洋）、電子 天 平（ＭＥＴＴＬＥＲ）、磁力攪拌器 （其林貝爾儀器制造有限公司）、電 泳 儀（北京 六 一 儀 器 廠）、ＰＣＲ 儀 （德 國 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司）、ＢＩＯＬＯＧ 微生 物 自 動 鑒 定 系 統（美 國 Ｂｉ－ ｏｌｏｇ 公 司 ）、凝 膠 成 像 系 統 （美 國 ＵＬＴＲＡ－ ＬＵＭ）。

１．２ 方法

１．２．１ 絮凝細菌的分離和篩選

用離心管稱取 活性污泥或生物膜各１ｇ，漩渦振蕩１０ｍｉｎ，然后 用滅菌蒸餾水進行梯度稀釋，取稀釋倍數為４、５、 ６的樣品涂布于ＬＢ培養基、牛肉膏蛋白胨培養基 和葡萄糖培養基，分別在４和３０℃的培養至長出 菌落，挑取單菌落，平板劃線分離純化菌株。純化 后菌株采用試管斜面保存、編號。 挑取上面純化后菌株接種于篩選培養基（葡 萄糖２％，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％，ＮａＣｌ ０．０１％，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．０２％，尿素 ０．０５％，酵母 膏０．０５％，ＭｇＳＯ４０．０２ ％）中，４ ℃培養７２ｈ，取 發酵液進行絮凝效率檢測。檢測方法為：取２ｍＬ 發酵液，加 入 ５０ ｍＬ 含 有 高 嶺 土 ０．４％、ＣａＣｌ２ ０．０４％的水懸濁液，磁力攪拌器上以２５０ｒ·ｍｉｎ－１ 攪拌 １ ｍｉｎ，再 以 ６０ｒ·ｍｉｎ－１ 攪 拌 ３ ｍｉｎ，靜 置 ５ｍｉｎ后于液面下２ｃｍ 處取樣，在分光光度儀上 檢測其 吸 光 度 Ａ５５０ｎｍ值，另取一份不加發酵液 的 高嶺土懸濁液作為空白，測得吸光度 Ｂ５５０ｎｍ值，根 據測得數據計算各菌株絮凝率。公式如下： 絮凝率（％）＝（Ａ－Ｂ）／Ａ×１００。

１．２．２ 絮凝細菌的菌種鑒定

菌種鑒定采用形 態學、生理生化實驗和細菌１６ＳｒＤＮＡ 序列 分 析 ３種方法。革 蘭 氏 染 色、菌 落 形 態、菌 體 形 態、和 生理生化實驗方法均參照《微生物實驗手冊》。 Ｂｉｏｌｏｇ細菌鑒定方法根據儀 器 操 作 手 冊，將 菌 株 Ｈ８制成適當濃度菌懸液，接種于９６孔細菌培養 板，培養４～２４ｈ，置于 分 光 光 度 計 中 檢 測，計 算 機自動分析菌種指紋圖譜并給出鑒定結果。 透射電鏡（ＴＥＭ）觀察：將 Ｈ８菌落滴到水中 制成菌液，靜置至細菌單細胞擴散，取銅網吸附細 菌細胞后用醋 酸 鈾 染 色３ ｍｉｎ，取下銅網晾干后ＴＥＭ 上觀察并拍照。

２ 結果與分析

選擇４ ℃對低溫菌進行分離培養，同 時以３０ ℃培養作為對照，３０ ℃培養 條 件 下 平 板 菌落的數量和種類明顯占優勢。，活性污泥和生物膜中都含有一定數量可以在 低溫下生長的細菌，根據３種培養基中菌落形態 的差別進行低溫菌株純化及保存，低溫生物反應 器中共分離到６４ 株低溫細菌，其中２９株來自活 性污泥，３５株來自生物膜。進一步的絮凝菌篩選 試驗結果證 明 低 溫 反 應 器 活 性 污 泥 中 大 約７９％ 的低溫菌具有絮凝活性。生物膜中的低溫菌是被固定在特定載體上，所以對菌株的絮凝性要求不 高，但是在初篩實驗中發現１３株低溫菌具有絮凝 活性，占分離菌株的３７％。絮凝性復篩主要考察 菌株絮凝穩定性和絮凝效率，選 取 絮 凝 率 超 過 ５０％的菌株，最后獲得活性污泥中５株絮凝細菌，和生物膜中５株絮凝細菌，其中 Ｈ８、ＤＧ２和 ＤＮ１三株菌徐 凝效果最好，均 超 過８０％。Ｈ８菌株 在 低 溫 下 生 長較 快，絮 凝 率 達 到 ８３．７９％ ，絮 凝 照 片菌株 Ｈ８的菌落呈圓形，有凸起，邊緣光滑整 齊，乳黃 色，不 透 明，大 小 約３．５ｍｍ×３．５ ｍｍ。 革蘭 氏 染 色 陽 性，菌 體 橢 圓 形，大 小 （０．１０± ０．０２）μｍ× （０．０６±０．００５）μｍ，無 鞭 毛、纖 毛（圖２）。生理生化試驗結果證明菌株 Ｈ８可以 水解淀粉、明膠，不能水解酪蛋白、纖維素，可發酵 乳糖產酸，不產生尿素酶，接觸酶試驗陰性，氧化酶試驗 陽 性，可 還 原 硝 酸 鹽，硫 化 氫 試 驗 陰 性， ＩＭＶＩＣ試驗中只有檸檬酸鹽試驗為陽性。

３ 結論

本試驗從低溫活性污泥和生物膜中共分離到 ７５株細菌，其中中溫菌有４６株，２９株在低溫下生 長的細菌。對分離到的細菌進行產絮能力的初篩 和復篩試驗，共得到４株絮凝顆粒大，絮凝效果好 的高效低溫產絮菌株，其中 ＤＧ２和 ＤＮ１來自 活 性污泥，絮凝率分別達到８７．３５％和８１．３３％，Ｈ８ 和 Ｈ１３來自生物膜，絮凝率分別達到為８３．７９％ 和７８．４４％。經多次重復試驗證明 Ｈ８的絮凝性 最好，且在低溫下絮凝效果穩定，該菌為乳黃色圓 形細菌，表面光滑濕潤且有凸起，不透明的革蘭氏 陽性菌。



 

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