1 材料與方法 

1. 1 材料與試劑

 20份油菜薹（甘藍型油菜，Brassica napus L.）樣 品采摘自中國農業科學院油料作物研究所試驗基 地，其它蔬菜小白菜（上海青，B. rapa spp. chinen? sis）、西蘭花（B. oleracea var. Italic Planch）和結球甘 藍（B. oleracea var. capitata）購買自實驗室周邊5個 超市和蔬菜市場。順式維生素K1、反式維生素K1和 維生素 K1-D7 標準品購自加拿大 Toronto Research Chemicals公司；甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中 國）有限公司；正己烷（色譜純）：國藥集團化學試劑 有限公司；乙酸乙酯（色譜級）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異丙醇：德國默克股份兩合公司； 甲酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸銨： 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Mega Bond Elut AL-N：美國Agilent公司；Mega BE-SI：美國Agi? lent 公司；Hicapt Benzo：維泰克科技（武漢）有限公 司 ；DIKMA ProElut C18：迪馬科技 ；Simon Aldrich PCX：德國 Simon Aldrich 公司 ；Sep-Pak Vac Silica Cartridges：美國 Waters 公司；DIKMA ProElut SI：迪 馬科技；Waters WCX：美國Waters 公司。

1. 2 儀器與設備

Waters YMC C30液相色譜柱（150 mm×4. 6 mm× 3 μm）：日本YMC株式會社；液相色譜三重四級桿串 聯質譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；3205 食品加工機：德國 Braun 公司（產地：匈牙利）；AUW220D 電子分析天平：日本島津公司；移液槍（100 μL、200 μL、1 mL、5 mL）：德國 Eppendorf 公司；XHC旋渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司；HITA? CHI CT6E 離心機：日本日立有限公司；DTC-27J 超 聲波水浴鍋：中國湖北鼎泰生化技術設備制造有限 公司；BCD-260WDBD型冰箱：青島海爾股份有限公 司；Test Tube Shaker KB-5010 搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；BF-2000型氮氣吹干儀：北京 八方世紀科技有限公司；50 mL具塞離心管：美國康 寧公司；10 mL 具塞離心管：中國上海貿易公司；一 次性無菌注射器：武漢市王冠醫療器械有限責任公 司；0. 22 μm 有機系濾膜：美國 Millipore 公司；250 μL玻璃內襯管：安捷倫科技有限公司；1. 5 mL進樣 小瓶：美國Agilent公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 標準溶液的配制

準確稱取標準品順式維 生素K1、反式維生素K1各50 mg于深棕色玻璃瓶中， 分別用色譜級甲醇溶解，定容至10 mL，混合均勻配 制成5 mg/mL的單一標準儲備液。 準確稱取1 mg維生素K1-D7同位素標準品于深 棕色玻璃瓶中，加入甲醇定容至10 mL，混合均勻配 制成 100 μg/mL 的維生素 K1-D7 同位素內標儲備 溶液。 使用移液槍準確移取母液于棕色瓶中，加入純 甲醇進行逐級稀釋，配制成所需不同濃度的單一標 準品溶液以及混合標準品溶液（不同濃度的混合標 準 品 溶 液 均 含 有 50 ng/mL 維 生 素 K1-D7 ），儲 存 于-20℃冰箱中，備用。

1. 3. 2 樣品制備、提取及測定

樣品應新鮮，洗凈 后，擦去表面水分，用食品加工機制成勻漿保存于 冰箱待用，用時置于室溫下解凍。 準確稱取 0. 5 g 蔬菜勻漿樣品于 50 mL 具塞離 心管中，加入 250 ng的同位素內標維生素 K1-D7，加 入5 mL異丙醇，渦旋混勻后超聲5 min。加入10 mL 正己烷，渦旋振蕩 10 min，然后以 4500 r/min 轉速離 心6 min，將上清液轉移至50 mL具塞離心管中。再 向下層溶液加入 10 mL 正己烷重復提取一次，在渦 旋混勻器上將沉淀旋開，振搖 10 min 后，以 4500 r/ min轉速離心6 min。合并上清液，正己烷定容至25 mL。然后用移液槍移取 5 mL 上清液于 10 mL 試管 中，氮氣吹干后加入1 mL正己烷溶解，待凈化。 中性氧化鋁柱用5 mL正己烷活化后，將上述正己烷復溶的1 mL提取液以1. 0 mL/min流速過柱，用 5 mL 正己烷以 1. 0 mL/min 流速淋洗小柱，最后用 8 mL正己烷：乙酸乙酯（80:20，V:V）溶液洗脫至10 mL 試管中，氮氣吹干后加入 1 mL 甲醇復溶，經 0. 22 μm 有機濾膜過濾至 1. 5 mL 進樣小瓶中，待 HPLCMS/MS分析。

2 結果與分析

油菜薹等蔬菜屬于低脂性樣品，但樣品中葉綠 素、類胡蘿卜等干擾物質含量較高，因此，檢測前需 選取合適的固相萃取柱對提取液進行凈化。本文 考察了 DIKMA ProElut C18，Waters WCX，Simon Al? drich PCX，Hicapt Benzo，DIKMA ProElut SI，Mega BE-SI，Sep-Pak Vac Silica Cartridges，Mega Bond Elut AL-N 8種常用的固相萃取柱。考察8種SPE柱 對正己烷提取液的凈化效果。圖 1 結果表明，中性 氧化鋁柱（圖 1中第 5個柱）對蔬菜基質的凈化效果 明顯優于其它7種固相萃取柱。中性氧化鋁柱洗脫 液顏色較淺，進一步說明其吸附葉綠素等干擾物質 能力強，凈化效果好。中性氧化鋁柱用于保留或去 除極性化合物，適用于醛、酮、醌和硝基化合物以及 在堿性介質中不穩定的物質的分離，因此，選擇中 性氧化鋁柱用于維生素K1的凈化分析。

3 討論

建立了油菜薹中維生素 K1順反異構體的分析 檢測方法。采用異丙醇和正己烷對油菜薹樣品進 行提取后，再用氧化鋁固相萃取柱凈化，能有效分 離維生素 K1，凈化除去葉綠素、類胡蘿卜素等干擾 物。選用維生素 K1-D7同位素作為內標進行定量， 可有效消除基質效應，提高回收率和檢測靈敏度。 通過 HPLC-MS/MS 選擇反應監測模式（SRM）,可以 降低噪音和基質背景，提高檢測的靈敏度。與國標 法相比本實驗實現了利用 C30色譜柱對順反式維生 素 K1進行分離。本方法中順式維生素 K1和反式維 生素 K1的檢出限分別為 0. 49 μg/kg、0. 29 μg/kg，定 量限分別為 1. 63 μg/kg、0. 95 μg/kg，相關系數均≥ 0. 9978，加標回收率在 87. 5%～117. 6% 之間，精密 度（RSD）在0. 72%～9. 59%之間。該方法樣品富集 凈化操作簡單、靈敏度高、結果準確，能夠滿足蔬菜 中維生素 K1順反異構體的檢測。

免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯系我們，我們會在第一時間進行處理。